一、病例摘要
患者1：34岁，因“同居6年，未避孕未孕”于2018-06-10入院。患者既往月经周期30~60d，基础性激素和超声检查提示多囊卵巢综合征。2017年于本院行输卵管碘油造影（HSG）示双侧输卵管梗阻。2018年6月第一周期月经期长方案助孕，获得10个卵母细胞（5个成熟,5 个未成熟），补救卵浆内单精子注射（R-ICSI），形成2个2原核胚胎，移植胚胎2个未孕；第二周期早卵泡期长方案助孕，适当放大卵泡尺寸至最大直径24.6mm，获得16个卵母细胞（2个成熟，14个未成熟），形成2个两原核胚胎，因胚胎质量差取消移植。全外显子测序找到致病基因变异（TUBB8, Arg2Lys/c.5G>A）。对其家系该位点进行Sanger 测序进行验证，发现患者父母均无此突变，此突变是新发突变。另外发现患者母亲存在一个SNP，Met1Thr/c.2T>C 杂合，属于TUBB8启动子突变，并证实该SNP异常是可自然妊娠的（图1）。
患者2：33岁，因“同居9年，未避孕未孕”于2019-08-01入院。患者既往2014年外院诊断子宫腺肌病及双侧卵巢子宫内膜异位囊肿，经过促排卵治疗后仍未孕；男方精液检查未见异常。在该院行月经期长方案促排卵一次，获卵11个，常规授精，形成4个胚胎，因胚胎质量差取消移植；2015年再次黄体期长方案促排，获卵8个，常规受精，形成胚胎2个，再次因胚胎质量差取消移植；2019年我院高孕激素状态下促排卵方案促排卵，获得8个卵母细胞（6个成熟，2个未成熟），常规授精，形成2个两原核胚胎，均为4级胚胎，因胚胎质量差取消移植。患患者及其父亲Ⅰ-1全外显子测序发现一个TUBB8错义突变（TUBB8, Arg391Cys/c.1171C>T Cgc/Tgc），提示患者的TUBB8错义突变来自于患者父亲。
患者3：27 岁， 因“ 同 居 2 年， 未 避 孕 未 孕” 于 2018-10-15 入院。患者既往 2017 年外院行输卵管碘油造影提示双侧输卵管梗阻，2018年在本院行早卵泡期长方案及高孕激素状态下促排卵方案促排卵各一次，获得15个卵母细胞（4个成熟,11个未成熟），常规授精，形成5个两原核胚胎，均为4级胚胎，因胚胎质量差取消移植。
患者4：31岁，因“同居6年，未避孕未孕”于2018-05-20入院。患者既往2016年因盆腔炎行腹腔镜手术切除左侧输卵管，2018年在本院行早卵泡期长方案及高孕激素状态下促排卵方案促排卵各一次，获得17个卵母细胞（10个成熟，7个未成熟），形成4个两原核胚胎，均为4级胚胎，因胚胎质量差取消移植。
4例患者均为原发性不孕患者，其配偶精液常规检 查均正常，累计进行了2~3个助孕周期，反复出现多数 卵母细胞成熟障碍、胚胎发育停滞。4例患者进行全外 显子测序及TUBB8（TubulinBeta8ClassVⅢ) 的多序 列比对，利用公共数据库（dbSNP150、1000genome、ExAc等）对过滤后的突变进行注释，得到突变频率信 息。通过去除人群中常见的变异位点，再结合功能注释 软件，如Polyphen2、SIFT、M-CAP及CADD分数等对 过滤后的变异进行蛋白功能影响预测，筛选出候选基因，然后结合临床表型，最终找到致病基因变异，再对其家系该位点进行Sanger测序进行验证。结果发现患者1及患者2存在TUBB8基因突变，患者3及患者4未发现突变，见表1。
图1 患者1家系检查及TUBB8突变定位
A：患者家系，填充圆表示先证者(Ⅱ-1），正方形或圆形 表示正常的家庭成员；B：TUBB8基因外显子序列。箭头 分别指向患者母亲(Ⅰ-2）p.Met1Thr/c.2T>C杂合，起始密码子缺失及患者( Ⅱ-1）杂合子变异株p.Arg2Lys/c.5G>A出现位置
二、讨论
一次促排卵周期获得的卵泡中有10%~ 15%是不成熟卵[1-2]，卵母细胞成熟停滞可以发生在细胞周期的不同阶段，临床发现0.1%~ 1%的患者多次促排卵，反复发生大部分卵母细胞成熟停滞且多数为同一时期[1]。国外学者Beall等[3] 称其为卵母细胞成熟障碍综合征。
MⅡ卵母细胞可以通过卵胞浆内单精子注射，完成受精和随后的卵裂。然而，卵子成熟包括核成熟和胞质成熟，有些可见第一极体排出仅反映卵子的核成熟，可能出现ICSI受精失败（M Ⅱ期停滞）和卵裂失败（两原核胚胎在体外受精过程中停滞）。使用人工卵母细胞激活克服上述现象也只取得了部分成功[4-5]。
2016年有学者报道原发不孕患者出现卵母细胞成熟障碍、胚胎发育停滞，系由于TUBB8基因突变破坏微管的功能和卵母细胞减数分裂纺锤体的组装，证实TUBB8基因突变是部分患者出现以上情况的原因[6-9]。
TUBB8是一种调节纺锤体形成的核心基因，该基因 突变所致卵子发育阻滞具有常染色体显性遗传性。在卵母 细胞和早期胚胎有不同的表现形式，包括生殖泡期停滞、M Ⅰ期停滞、M Ⅱ期停滞（受精失败）、两原核胚胎停滞 （卵裂失败）和早期胚胎发育停滞（小于4细胞期）[10]。
患者1在第1周期中仅获得5细胞Ⅲ级胚胎和6细胞Ⅲ级胚胎各一个。在第2次助孕周期中适当放大卵泡后扳机，经过体外培养后大部分卵母细胞仍停滞于生殖泡期，对该患者进行了全外显子测序，找到致病基因变异（TUBB8,Arg2Lys/c.5G>A），并证实该突变是新发突变。另外发现患者母亲存在一个SNP，Met1Thr/c.2T>C杂合，属于TUBB8启动子突变，未见文献报道，系我中心第一次报道，并证实该SNP异常是可自然妊娠的。
患者2外院两次和本院一次助孕，均因胚胎质量差取消移植。3次助孕选择了不同的促排卵方案，但是受精的卵母细胞，胚胎可以分裂，在早期阶段发育停滞，对患者及其父亲全外显子测序发现一个TUBB8错义突变（TUBB8,Arg391Cys/c.1171C>TCgc/Tgc），提示患者的TUBB8错义突变来自于患者父亲。文献报道TUBB8p.R391C突变的患者卵母细胞部分可以受精卵裂，但会在后期的胚胎发育出现缓慢或分裂停滞[1]，这与临床观察保持一致。
目前针对卵母细胞成熟障碍及胚胎发育障碍，临床上可以尝试调整促排卵方案、更换扳机剂型、放大夜针日卵泡直径、延长扳机至取卵时间、延长体外培养时间、联合 生长激素行未成熟卵子体外成熟培养及卵子激活剂等改善卵母细胞成熟度及改善胚胎质量的方法，但效果欠佳[11]。因此，对于此类患者供卵可能是一个比较理想的选择。
参考文献
[1] 苑丽华,宋景艳,孙振高.卵母细胞成熟障碍病因和治疗手段的最新研究进展[J].现代妇产科进展,2017,26(6):468-
470. DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2017.06.033.
[2] 杨萍. 卵母细胞成熟障碍的致病基因研究[D]. 山东大学,
2021. DOI:10.27272/d.cnki.gshdu.2021.000085.
[3] BeallS,BrennerC,SegarsJ.Oocytematurationfailure:asyn-drome ofbad eggs[J]. Fertil Steril. 2010, 94(7): 2507-2513. DOI:10.1016/j.fertnstert.2010.02.037.
[4] VandenMF,NikiforakiD,HeindryckxB,etal.AssistedoocyteactivationfollowingICSIfertilizationfailure[J].ReprodBiomedOnline, 2014, 28(5): 560-571. DOI:10.1016/j.rbmo.2014.01.008.
[5] 孙一鸣,徐丛剑,王磊.人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常的遗传学研究进展[J]. 中华生殖与避孕杂志.2020,40(11): 943-951. DOI:10.3760/cma.j.cn101441-20191112-00506.
[6] Feng R, Sang Q, Kuang Y, et al. Mutations in TUBB8andHumanOocyteMeiotic Arrest[J].NEnglJMed,2016,374(3):223-232.DOI:10.1056/nejmoa1510791.
[7] HuangL,TongX,LuoL,etal.Mutationanalysisof theTUBB8geneinnineinfertilewomenwithoocytematurationarrest[J].ReprodBiomedOnline,2017,35(3):305-310.DOI:10.1016/j.rbmo.2017.05.017.
[8] WangAC,ZhangYS,WangBS,etal.MutationanalysisoftheTUBB8geneinprimaryinfertilewomenwitharrestinoocytematuration[J]. Gynecol Endocrinol, 2018, 34(10): 900-904. DOI:10.1080/09513590.2018.1464138.
[9] Chen B,WangW,PengX,etal.ThecomprehensivemutationalandphenotypicspectrumofTUBB8infemaleinfertility[J].Eur J Hum Genet, 2019, 27(2):300-307.DOI:10.1038/s41431-018-0283-3.
[10] YuanP,ZhengL,LiangH,etal.A novel mutation inthe TUBB8geneisassociatedwithcompletecleavagefailureinfertilizedeggs[J].JAssistReprodGenet,2018,35(7):1349-1356.DOI:10.1007/s10815-018-1188-3.
[11] 邓陶然,黄博,杜瑶瑶,等.卵母细胞成熟障碍综合征一例报告[J].中国优生与遗传杂志,2017,25(12):115-118.DOI:10.13404/j.cnki.cjbhh.2017.12.047.
